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    瓊脂糖凝膠電泳的原理介紹
    更新時間:2023-08-09   點擊次數:1285次

    實驗原理
        瓊脂糖凝膠電泳常用于分離、鑒定 DNA、RNA 分子混合物,以瓊脂凝膠作為支持物,利用 DNA 分子在電場中時的電荷效應和分子篩效應,達到分離混合物的目的。DNA 分子在高于其等電點的溶液中帶負電,在電場中由陰極向陽極運動。在一定的電場強度下,忽略DNA分子攜帶的電荷,DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應,即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。DNA 分子的遷移速度與相對分子量成反比。
        不同構型的 DNA 分子的遷移速度不同。如環形 DNA 分子樣品,其中有三種構型的分子:超螺旋分子(cccDNA)、開環分子(ocDNA)、和線形 DNA 分子(IDNA)。這三種不同構型分子進行電泳時的遷移速度大小順序為:cccDNA>IDNA>ocDNA。
        核酸電泳通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種介質。瓊脂糖是一種聚合鏈線性分子;聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺(Acr)在 N,N,N′-四甲基乙二胺(TEMED)和過硫酸銨(AP)的催化下聚合形成長鏈,并通過交聯劑 N,N′-亞甲雙丙烯酰胺(Bis)交叉連接而成。瓊脂糖凝膠適合分離200bp至近50kb的DNA片段,而聚丙烯酰胺凝膠對于小片段(5bp-500bp)的分離效果很好,且分辯力高。選擇不同濃度的凝膠,可以分離丌同大小范圍的 DNA 分子。電場強度愈大,帶電顆粒的運動赹快。但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而減小,所以電泳時一般采用低電壓,不超過 6V/cm。而對于大片段電泳,可以選擇 0.5-1.0V/cm 電泳過夜。如果選擇高電壓電泳,可使用聚丙烯酰胺凝膠。
        核酸電泳常采用 TAE、TBE、TPE 三種緩沖系統。TAE 價格低廉,但緩沖能力低。TPE 在進行 DNA 回收時,會使 DNA 污染磷酸鹽,影響后續反應。所以綜合考慮,多采用 TBE 緩沖液。
        核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠(EB)。溴化乙錠是一種扁平分子,可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間。在紫外線照射 BE-DNA 復合物時,通過發光指示核酸的位置。由于EB有較強的揮發性和毒性,現在大多選擇EB替代品進行試驗,比較常用的有gelred,goldview,ybr-green等,但是整體效果都若于傳統的EB。
    材料、試劑及器具
    1、材料
    合適的Marker(分子量標準);DNA 樣品
    2、試劑
    加樣緩沖液(6x或10x);瓊脂糖;溴化乙錠(EB)。
    3、器具
    (1)電泳系統:電泳儀、水平電泳槽、制膠板等。
    (2)凝膠成像系統或紫外透射儀。
    實驗過程
    1、按所分離的 DNA 分子的大小范圍,選擇合適的比例的凝膠,稱取適量的瓊脂粉,放到一錐形瓶中,加入適量的 TBE電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至瓊脂粉完溶化,溶液透明。稍搖勻,得膠液。待膠液卻至 60℃左右,在膠液內加入適量的比例的溴化乙錠液。
    2、水平放置膠槽,在一端插好梳子,在槽內緩慢倒入已況至 60℃左右的膠液,使之形成均勻水平的膠面。
    3、待膠凝固后,小心拔起梳子,使加樣孔端置陰極段放進電泳槽內。
    4、在槽內加入TBE電泳緩沖液,至液面覆蓋過膠面。
    5、把待檢樣品,按合適比例與加樣緩沖液混勻,用移液槍加至凝膠的加樣孔中。
    6、接通電泳儀和電泳槽,并接通電源,調節合適電壓,穩壓輸出,開始電泳。
    7、觀察溴酚蘭的帶(藍色)的位置。當其移動至約凝膠長2/3處時,可停止電泳。
    8、在紫外透視儀的樣品臺上重新鋪上一張保鮮膜,趕去氣泡平鋪,然后把凝膠放在上面。關上樣品室外門,打開紫外燈(360nm 或 254nm),通過觀察孔進行觀察。

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