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    細胞復蘇實驗步驟及注意事項
    更新時間:2023-06-04   點擊次數:1308次

    細胞復蘇是與細胞凍存的過程相反,是指將凍存在液氮或者-80℃冰箱中的細胞解凍之后重新培養,使細胞恢復生長。當恢復到常溫狀態時,細胞的形態結構和生化反應恢復正常水平。與細胞凍存不同,細胞復蘇過程升溫要快,防止在解凍過程中水分進入細胞,形成冰晶,影響細胞存活率。

    實驗材料
    基礎培養基                           
    血清(常規為FBS/NBS)
    電動移液槍 
    移液槍
    移液管[NEST]
    無冰冰盒[NEST]
    T25培養瓶[NEST]
    自動旋蓋機[NEST]
    盒裝無菌吸頭[NEST]
    100mm細胞培養皿[NEST]
    15mL、50mL無菌離心管[NEST]


    01 不能忘記的準備
    1.記得一定要預定干冰!!!不然你細胞取出來可沒地方待了,要是液氮罐距離實驗室遠點,你的細胞可能就沒了。
    2.用來轉移細胞的無冰冰盒一定要滅菌!!!當然,如果條件刻苦點的泡沫盒,也不要偷懶,無論什么裝載容器,都要提前滅菌,可以有效規避污染風險。
    3.水浴鍋提前預熱至37℃。
    4.培養基預熱至37℃。


    02 要開始了!(敲黑板)
    1.在生物樣本庫中搜尋到目標細胞,在液氮罐找到對應的細胞,放入預先準備好的無冰冰盒(容器)內。冰盒內裝有碎干冰,冰芯的鋁合金外殼協同高導熱的合金模塊,確保樣品能快速冷卻,孔之間的溫度差異小于0.1℃,能很好的維持樣品間的溫度一致性。
    2.在細胞進入水浴鍋解凍前,務必將凍存管豎直立在桌面上10~20s,這樣之后,可以排空可能存在在凍存管蓋縫隙內的液氮。尤其是外旋蓋的凍存管,特別要注意!不然在水浴解凍的時候有概率會砰的一聲爆發出來!極為危險。
    3.將凍存管在37℃水浴鍋內水浴解凍,因為DMSO在常溫情況下對細胞有毒副作用,若解凍時間過長,會導致細胞損傷并影響其存活率,所以一定要快,解凍過程在1~2min內完成。
    4.解凍完成后,在生物安全柜內,用自動旋蓋機打開凍存管,之后在移液槍將凍存管內細胞復懸,然后將細胞懸液轉移至含有5~10ml培養基的離心管中,1000rmp離心5min(根據各自細胞的特新調整離心力和離心時間)。如果沒有培養基稀釋,在離心過程中較高濃度的DMSO會對細胞損傷,影響細胞存活率!
    5.丟棄上清,里面還有DMSO和去細胞的裂解產物,這不是我們所需要的。將剩余的細胞用培養基稀釋復懸,稀釋比例為1:10~1:15,再按照大家各自實驗需求,分裝到100mm培養皿或者T25瓶中,顯微鏡觀察細胞狀態,然后轉移至細胞培養箱中培養。


    03 復蘇后的注意點
    復蘇后記得每天都要觀察細胞狀態,及時更換培養基,確保細胞所需營養的充足和生長環境的清潔。


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