4 PCR反應特點

4.1特異性強   
PCR反應的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；
②堿基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；
④靶基因的特異性與保守性。
4.2 靈敏度高
PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10^-12)量級的起始待測模板擴增到微克(μg=10^-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。
4.3簡便、快速
PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，經(jīng)過變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。
4.4 對標本的純度要求低
不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。

5 PCR常見問題

5.1假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶
PCR反應的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有：
（1）模板核酸的制備
①模板中含有雜蛋白質(zhì)；
②模板中含有Taq酶抑制劑；
③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白；
④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚；
⑤模板核酸變性不底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本
的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，
其程序亦應固定不宜隨意更改。
（2）引物的質(zhì)量與特異性
引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條
帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一
條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：
①選定一個好的引物合成單位。
②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有
引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物
無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度
高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。
③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物
變質(zhì)降解失效。
④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
（3）酶的質(zhì)量
             酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。
（4）Mg²⁺濃度
Mg²⁺離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異
性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
（5）反應體積的改變
通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul或100ul，應用多大體積
進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，
再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
（6）物理原因
變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)
假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高
影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢
測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
（7）靶序列變異
如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺
失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。
5.2 假陽性
　　    出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
　　   （1）引物設計不合適
選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，
擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假
陽性。需重新設計引物。
　　   （2）靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染
這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。
這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍
內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應高壓消
毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管
和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這
些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴
增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
5.3 出現(xiàn)非特異性擴增帶
　　       非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不全互補、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg²⁺離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。對策有：
①必要時重新設計引物；
②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶；
③降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)；
④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。
5.4出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
　　       PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg²⁺濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。對策為：
①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。
②減少dNTP的濃度。適當降低Mg²⁺濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。