1、變性

90～94℃的高溫處理可使模板 DNA 雙鏈間氫鍵斷裂,解離成單鏈但不改變其化學性質,變性的時間一般為30s,如果模板的 G+C 含量較高,變性時間可能延長。

2、退火

退火的溫度一般降低至25～65℃。在退火過程中,引物分別與待擴增的 DNA 片段的兩條鏈的3'端互補配對。退火的溫度取決于引物的 T_m 值,并通過預備試驗來最后確定。一般引物越短,其 T_m 也越低,對于10bp 左右的隨機引物,退火溫度在37℃左右,反之則高。退火溫度越高,引物與模板結合的特異性增強,非特異性的擴增概率降低,但擴增效率也隨之降低。相反,隨著溫度的降低,引物與模板非特異性結合的概率提高。引物的長度越長,其退火溫度則越高,否則會發生非特異性結合,降低 PCR 產物對模板的忠實程度。退火時間一般為30s。

3、延伸

Taq DNA 聚合酶的最適溫度為70～74℃,在此溫度下 Taq DNA 聚合酶以單鏈 DNA 鏈為模板,將單核苷酸逐個加入到引物的3'端,使引物不斷延長,從而合成新的 DNA 鏈。新合成的引物延伸鏈在下一輪循環時就可以作為模板。反應步驟的溫度和時間可以根據實驗要求自行設定,一般要經過20～30個循環,擴增產物需要經瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。